Мультиспора – это…

ЖИЗНЕННЫЙ ЦИКЛ ГРИБА
Культивация грибов это одна из лучших возможностей для наблюдения Жизненного Цикла Гриба во всей его полноте. Жизненный цикл начинается со споры, которая порождает первичный мицелий. Вторичный появляется при скрещивании клеток мицелия произошедших от двух разных спор. Этот мицелий продолжает развиваться вегетативно. Когда вегетативный мицелий созреет, его клетки будут способны на феноменально быстрый уровень деления, на пике которого он возводит плодовые тела грибов. Это последнее функциональное изменение в результате которого он становится третичным мицелием. Эти три типа мицелия представляют собой три последовательные фазы жизненного цикла гриба.

Споры большинства грибов генетически гаплоидны (1N) и одноядерны. Это значит что каждая спора содержит в себе одно ядро и половину набора хромосом своего вида. Таким образом у споры есть «пол» в том смысле что для созревания до мицелия способного к произведению потомства ей необходима спора противоположного типа. Сразу после выбрасывания споры представляют собой полностью готовые к прорастанию объёмные «влажные» клетки. Но вскоре начинается их обезвоживание и высыхая стенки клетки свёртываются к центру. В таком виде они смогут находится в состоянии покоя, пережидая сухие сезоны или сильные засухи. Когда погодные условия смягчатся и предоставят достаточный уровень влажности споры снова напитаются влагой и вернутся к прежнему объёму. Только в этом случае возможно прорастание спор.

В пределах одного вида структура и форма спор в некоторой степени схожи. Однако если рассматривать споры разных видов то можно заметить значительные отличия. Некоторые гладкие в и имеют форму лимона (род Copelandia, к примеру); многие эллиптические (как у рода Psilocybe); тогда как другие обладают неправильной формой и сложной структурой поверхности (Lactarius или Entoloma). Верхушечные зародышевые поры присутствуют у спор многих грибов и особенно у псилоцибиновых видов.

Зародышевая пора это округлое углубление на одном конце споры из которого выпускается гаплоидная ниточка мицелия, называемая гифом. Гиф продолжает расти и разветвляясь образует мицелиальную сеть. При встрече двух генетически взаимодополняющих гифовых сетей в момент соприкосновения стенки клеток входящих в контакт растворяются и происходит обмен цитоплазматическим и генетическим материалом. Эротично это или нет, но это «грибной секс». Весь мицелий появляющийся впредь будет двухъядерным и дикариотическим. Это означает, что в каждой клетке будет содержаться два ядра и полный набор хромосом. За несколькими исключениями, только полностью зрелый (дикариотический) мицелий способен к производству плодовых тел. Обычно дикариотический мицелий быстрее колонизирует субстрат и в принципе более сильный, чем монокариотический. Плодоношение уже принципиально возможно, как только мицелий вступает в дикариофазу. У Psilocybe cubensis период между прорастанием спор и появлением зачатков плодовых тел может занять всего две недели; у некоторых видов Panaeolus это может произойти уже через неделю. У большинства грибов тем не менее на это уходит несколько недель или месяцев.

Культиваторы занимающиеся выведением новых штаммов путём скрещивания выделенных односпоровых культур используют как признак для определения зрелости (перехода в дикариофазу) мицелия наличие так называемых спаечных соединений. Спаечные соединения это микроскопические мосты объединяющие две клетки и встречаются они только в дикариотическом мицелии. Спайки можно легко увидеть даже с помощью слабого микроскопа с увеличением X100–400. Не все виды образуют спаечные соединения. (Agaricus brunnescens не образуют, зато почти все виды Psilocybe и Panaeolus образуют). И напротив у мицелия полученного из гаплоидных спор спайки отсутствуют. Эта характерная особенность является бесценным инструментом для исследователя выводящего новые штаммы.

Две сети мицелия растущие вместе могут обменяться генетической информацией и образовать новый штамм. Это случается при объединении двух гифальных систем и называется анастомоз. А если пересекаются две несовместимых колонии мицелия, то зачастую в месте их встречи образуется участок подавленного роста. На агаре подобный участок несовместимости будет виден невооружённым взглядом.

Когда мицелий начинает плодоносить в его метаболизме происходит несколько радикальных перемен. До этого момента он развивался вегетативно. В вегетативной стадии гифальные клетки накапливают питательные вещества. Удивительно что количество ядер в каждой клетке постепенно увеличивается и иногда даже достигает десяти в момент перед началом образования примордий. Непосредственно перед формированием плодовых тел эти ядра передаются через стенки вновь образующимся клеткам и их количество усредняется до двух на клетку. По-видимому такое увеличение количества ядер является необходимым условием для плодоношения у многих видов грибов.

По мере формирования гимениальных пластинок появляется всё больше базидиальных клеток, проявляясь поначалу маленькими пузырьками напоминающими булыжную мостовую. Базидия – это основная цель репродуктивной фазы жизненного цикла гриба. Тем не менее базидии не созревают все сразу. К примеру у вида Panaeolus базидиальные клетки появляются очагами придавая поверхности пластинок пятнистый вид. Клетки из которых образуется базидия обычно двухъядерные, и т.к. каждое ядро содержит одинарный набором непарных хромосом (1N), то клетка является дикариотической. И состав новых базидиальных клеток сходный. В определённый момент времени два ядра базидии начинают движение навстречу друг другу и объединяются в одно целое диплоидное (2N) ядро. Это превращение известно как кариогамия. Вскоре после этого диплоидное ядро претерпевает мейоз в результате которого обычно рождаются четыре гаплоидных дочерних клетки.

На поверхности базидии возникают стеригмы – выступы похожие на щупальца, по которым движутся эти ядра. У большинства видов на кончиках этих выступов образуются четыре споры. Споры продолжают развиваться до тех пор пока некое усилие не вытолкнет их в пространство. Сам механизм освобождения споры пока не объяснён учёными. Но наиболее распространённая в микологическом сообществе модель основывается на предпосылке что это происходит из-за пузырька газа образующегося в месте соединения споры и стеригмы. Пузырёк газа надувается и взрывается «отстреливая» спору в полость между пластинками откуда её уносят воздушные потоки. Обычно подобным образом освобождаются и другие споры. Спороношение завершает жизненный цикл гриба.

Не у всех видов грибов базидии производят четыре гаплоидных споры. Agaricus brunnescens (= Agaricus bisporus), обычный шампиньон, обладает базидиями с двумя диплоидными (2N) спорами. Это означает, что мицелий полученный из одной такой споры уже полностью готов к плодоношению. Agaricus brunnescens – это только один пример диплоидного биполярного вида. У некоторых Copelandian Panaeoli (сильно синеющие виды рода Panaeolus) две споры и те же условия созревания что и у Agaricus brunnescens. У других видов грибов базидии только с тремя спорами; у некоторых с четырьмя; а у несколько видов, таких как лисичка обыкновенная, на каждую базидию приходится восемь спор!

Осведомлённость начинающего грибовода о жизненном цикле значительно упростит первые попытки выращивания грибов. Как только будет достигнуто понимание сути грибной культуры и жизненного процесса этих организмов, культиватор сможет перейти к более сложным и интересным темам, таким как генетика и селекция штаммов. Такой всесторонний подход способствует углублению понимания вопроса и закладывает фундамент для развития инновационного подхода к разведению грибов.

ОТВЕТВЛЕНИЯ МУЛЬТИСПОРОВОЙ КУЛЬТУРЫ
Мультиспоровая культура это наименее сложный способ получения жизнеспособного мицелия, но не абсолютно чистого штамма. Прорастая в большом количестве, споры фактически создают множество штаммов, некоторые из которых несовместимы с другими, обладают разными потенциалами роста и нуждаются в различных условиях для плодоношения. Такая смесь штаммов подавляет рост более активных из них. В целом штаммы полученные из спор с большой вероятностью наследуют свойства своих предков. Если родители быстро захватывали субстрат и хорошо плодоносили в лабораторных условиях, то можно ожидать схожего поведения и от потомства. Культуры же полученные от дикорастущих образцов напортив в искусственных условиях обычно плодоносят плохо. Как и в случае с дикорастущими растениями, штаммы дикорастущих грибов необходимо совершенствовать селекцией.

Из многих штаммов получаемых из спор некоторые могут быть способны только на вегетативный рост. Такой мицелий может усваивать питательные вещества, но не способен образовывать плодовые тела (следствие генеративного роста). Клеточная сеть растущая из единственной споры называется монокариотической. Монокариоты не способны к производству спорообразующих плодовых тел. При встрече и слиянии двух совместимых монокариотов происходит обмен цитоплазматическим и генным материалом. Полученный в результате дикариотический мицелий уже может производить плодовитое потомство. Сетеобразное объединение ветвей различных дикариотических штаммов называется анастомоз. Такая рекомбинация возможна на любой стадии выращивания мицелия: на агаре, зерне, или уже в бедном субстрате. Подобные пересечения грибных штаммов аналогичны созданию гибридов в садоводстве.

Другой способ создания культуры заключается в выделении отдельных спор разбавлением в объёме стерильной воды. Далее эта споровая взвесь разводится ещё б?льшим количеством стерильной воды, которое уже в свою очередь и используется для инокуляции чашек с носителем. В этом случае культиватор получает возможность наблюдать за отдельными монокариотами и самостоятельно управлять процессами слияния для выведения высокоурожайных штаммов. Плодоводы нуждающиеся исключительно лишь в получении жизнеспособных культур эту технику могут опустить, т.к. их должно полностью удовлетворить мультиспоровое разведение. Но для тех, кто заинтересован в скрещивании монокариотических штаммов и изучении характеристик получаемых таким образом культур, этот метод окажется бесценным. Помните, что из сотни спор прорастает в среднем от одной до пяти.

Наибольшая опасность в приготовлении концентрированных мультиспоровых взвесей скрывается в увеличенной вероятности заражения, особенно бактериального. Некоторые бактерии паразитируют на клеточных оболочках мицелия, тогда как другие стимулируют прорастание спор для дальнейшего перемещения и медленного переваривания самого мицелия. Поэтому некоторые штаммы нездоровы изначально и обычно ассоциируются с высоким уровнем заражений. При попытке прорастить споры в очень большом количестве, те из них что уже инфицированы увеличивают вероятность распространения болезни на соседние.

Многие грибы, тем не менее, образуют уникальные симбиотические связи с другими микроорганизмами. Как ни удивительно, некоторые бактерии и дрожжи стимулируют развитие спор, которые в случае стерильной культуры было бы сложно прорастить. Споры Cantharellus cibarius, обычной и высоко ценимой лисички, не прорастали в искусственных условиях, противостоя усилиям лучших микологов мира. Но относительно недавно шведский миколог Nils Fries (1979) установил, что при добавлении в среду активированного угля и красных дрожжей (Rhodotorula glutinis (Fres.) Harrison) споры вскоре успешно прорастают. (Использование активированного угля рекомендуется для любых грибов с затруднённой всхожестью спор.)

Многие плодоводы сообщают, что определённые культуры пышно разрастаются при случайном заражении или намеренном внесении бактерий. Было установлено что Pseudomonas putida, Bacillus megaterium, Azotobacter vinelandii и некоторые другие микробы оказывают схожий эффект на различные виды грибов — и на прорастание спор, и на рост мицелия или образование плодовых тел. Однако большинство контаминантов с которыми приходится сталкиваться при разведении грибов, перенесены ли они воздушным путём или уже находились на спорах, делу не помогают. Из всех конкурентов наиболее пагубны бактерии. Прилежное соблюдение норм лабораторной гигиены, использование HEPA-фильтров и правильные методы лабораторной работы призваны справится с этой напастью.

ПОЛУЧЕНИЕ КУЛЬТУРЫ ИЗ ЖИВОЙ ТКАНИ
Культура из ткани является гарантированным способом сохранения соответствующих генетических признаков конкретного гриба. Мицелий полученный из ткани в точности клонирует образец, тогда как мультиспоровая культура образует новый штамм. Ткань для клонирования гриба необходимо брать в течении 24–48 часов с момента сбора. Выделение чистой культуры вызовет затруднения, если образец уже пролежал несколько дней, слишком сухой или перезрелый. С другой стороны споры сохраняются в течение долгого времени.

Так как весь гриб состоит из уплотнённого мицелия, то жизнеспособную культуру можно получить из любой части плодового тела гриба. Шляпка, верхняя часть ножки и/или область где пластинки соединяются с нижней частью шляпки являются лучшими местами для иссечения чистой ткани. Шляпку некоторых грибов покрывает кутикула. Сорвав эту тонкую кожицу также можно взять ткань из мякоти расположенной под ней. Протрите поверхность гриба ватным тампоном смоченным в спирте и удалите всю грязь и повреждённую внешнюю ткань. Надломите шляпку или ножку гриба, обнажая его внутренние гифы. Незамедлительно разогрейте скальпель докрасна и остудите его в чашке Петри со средой. Теперь надрежьте мякоть и извлеките маленький кусочек ткани гриба. Перенесите этот фрагмент ткани в центр чашки Петри с питательной средой как можно быстрее, избегая продолжительного контакта как ткани так и агара с открытым воздухом. Повторите все действия и поместите культуру ещё в три или ещё лучше пять чашек. Пометьте каждую чашку видом гриба, датой, типом культуры (ткань) и разновидностью агаровой среды. При благоприятном стечении обстоятельств по прошествии от трёх до семи дней рост мицелия будет очевиден.

10% – это общесредний уровень заражений, с которым грибовод может смириться. Тем не менее в первичных культурах, когда образцы берутся от диких видов, не будет чем-то необычным уровень контаминации в 25%. Разнообразные и красочные заражения появляются обычно недалеко от точки пересадки на агар. Количество появившихся контаминантов зависит от чистоты образца ткани или спор, а также от гигиенический условий лаборатории. В культуре клонированной из ткани гриба чаще всего встречаются бактериальные заражения.

Заражение это факт жизни каждого грибовода. Контаминанты только тогда становятся проблемой, когда их количество увеличивается сверх всяких разумных пределов, что можно считать признаком грядущей катастрофы в лаборатории. Если пять, десять или даже пятнадцать процентов можно считать нормальным уровнем контаминации для любого культиватора, то резкий скачок без каких-либо видимых изменений в условиях поддержания гигиены может стать причиной для поисков новых способов борьбы.

Как только ткань покажет признаки роста её следует переместить в другую чашку. Если нет явных признаков заражения, то быстрая пересадка не столь необходима. Если по соседству уже развивается плесень и г товится выбросить споры, то культуру следует сразу же изолировать. Продолжайте переносить культуру, отделяя её от контаминантов, пока не получите чистый штамм. Очевидно что выделить мицелий из частично заражённой культуры гораздо сложнее, чем пересадить из чистой. Попытки изолировать мицелий от соседствующих контаминантов усложняются опасностью распространения их спор. К тому же незримо для нас, когда мы поднимаем крышку чашки Петри в неё врывается внешний воздух и споры плесени разносятся его потоками в атмосферу лаборатории. Таким образом, чем быстрее культиватор обретёт независимость от инфицированных чашек, тем скорее сможет вывести чистую культуру. Тем не менее помните, что не смотря на то что невооружённому глазу культура может казаться чистой, в ней всё ещё могут скрываться споры контаминантов. Присутствие затаившихся плесеней или бактерий в мицелии станет видимым только тогда, когда вы инокулируете им стерильное зерно.

Различные меры могут быть предприняты для минимизации уровня заражения в лаборатории. Мы уже обсудили применение распыляемого масла, HEPA-фильтров и главбоксов. Но ваше личное отношение к заражению и чистоте в лаборатории много важнее любой её части. Авторам случалось видеть высокотехнологичные лаборатории с высоким уровнем контаминации и чуланы с относительно низким. Дадим два совета придерживаясь которых начинающие культиваторы должны преуспеть:

1. Приложите максимум стараний к первой попытке создания стерильной культуры. Всё должно быть чисто: лаборатория, одежда, инструменты и особенно сам культиватор.

2. Получив чистую культуру примените максимум усилий для поддержания её чистоты. Сохраняйте только те чашки Петри, в которых нет признаков плесени или бактерий. Выбрасывайте все инфицированные чашки, несмотря на то что они могут быть заражены только частично.

Не отчаивайтесь если столкнётесь с неудачей после первой попытки. Работа со стерильными культурами пойдёт просто и гладко, но только после некоторой практики, когда вы наберётесь немного опыта.

Работа с агаром это только первый шаг в разведении грибов. Для выращивания грибов сам по себе агар непрактичен. Его преимущества для работы с грибной культурой заключаются в возможности быстро разрастить мицелий из малейшего кусочка ткани. И достаточно легко поддерживать чистоту такой культуры, т.к. любое заражение легко заметить на плоской поверхности агаровой среды в чашке Петри.

СЕГМЕНТИРОВАНИЕ: СЕЛЕКЦИЯ И УЛУЧШЕНИЕ ШТАММОВ
Захватывая поверхность агара мицелий демонстрирует поразительное разнообразие форм. Некоторые культуры довольно однообразны на вид, тогда как другие поначалу проявляя полиморфность (неоднородность) позже неожиданно развиваются в гомогенный (однородный) мицелий. В этом природа мицелия – непрерывно изменяться и эволюционировать.

Мицелий называется сегментированным, когда развиваясь из единственной точки инокуляции в разные стороны он показывает разные типы роста. Сегмент определяется исключительно по внешнему виду контрастирующему с окружающим преобладающим типом мицелием. Существует два основных типа роста мицелия: ризоморфный (корнеобразный, нитевидный) и войлочно-опушённый (ватный, облачками). К тому же встречаются и промежуточные типы линейного роста, ориентированные относительно радиальных направляющих (к стенкам чашки), но не имеющие выраженных скрученных нитей или переплетённых гифов характерных для ризоморфного типа роста. Ризоморфный мицелий более предрасположен к образованию примордий. Линейный мицелий тоже склонен к обильному образованию примордий, но делает это обычно после того как преобразуется в ризоморфный. Однако не забывайте о том, что характеристики внешнего вида плодоносящего мицелия так же зависят о разновидности гриба и могут немного отличаться от приведённых выше.

В чашке плотно поросшей ватным мицелием, веероподобная веточка жилистого мицелия будет называться ризоморфным сектором, и наоборот. Сегментирование очень часто встречается на культуре грибов, но так же очень мало известно о назначении и причинах появления сегментов. Очевидно, что большую роль в этом играют генетические свойства, возраст мицелия и состав питательной среды.

Согласно Stoller (1962) рост пушистых сегментов обусловлен присутствием в субстрате взорванных или сломанных зёрен, которые увеличивают содержание крахмала в носителе грибницы. Работая с Agaricus brunnescens Stoller заметил, что рост мицеля быстрее при высоких значениях pH (7,5), чем при отклонении pH в кислотность (6,5), но сегментирование случается чаще. Он выяснил что сегментирование на зерне можно сократить, уменьшив количество раскрывшихся зёрен (результат наличия избыточной влаги), и понизив pH до 6,5 используя комбинацию мела (углекислый карбонат кальция) и гипса (сульфат кальция).

Коммерческие грибоводы давно заметили, что медленно растущий ватный мицелий уступает более быстрому ризоморфному. Существует несомненная зависимость между пушистым видом мицелия на агаре и последующим образованием «стромы», плотного сплетения гифов мицелия покрывающего кейсинг, через которое редко прорастают грибы. Кроме того, примордии чаще образуются на ориентированном на плодообразование ризоморфном, нежели на склонном к вегетативному росту ватном мицелии. И ещё один интересный факт: при наблюдении под микроскопом гифы ризоморфного мицелия выглядят более толстыми и менее разветвлёнными, чем у ватного.

Ризоморфный мицелий быстрее захватывает субстрат, образует больше примордий и в результате лучше плодоносит, чем пушистый мицелий. Это видно на Фото 37. Ломтик был пересажен на агар и из него выросли два различных типа мицелия. Сегмент с нитевидным ростом образовал многочисленные примордии, тогда как на ватном мицелии ничего не появилось – такое часто случается на агаре.

По мере роста мицелий постепенно начинает стареть. Стареющий мицелий, как и любое пожилое растение или животное, гораздо менее жизнеспособен и плодовит, чем молодой. Вообще превращение мицелия из нитевидного в ватный служит сигналом начала вырождения штамма. Если культура изначально ризоморфная со временем начинает сегментироваться, существует несколько способов предотвращения деградации штамма и сохранения ризоморфизма.

1. Производить пересадку только ризоморфных секторов и избегать ватных.
2. Регулярно меняйте питательный носитель используя приведённые здесь формулы. Не желательно использовать одну и ту же агаровую среду, т.к. питательный состав носителя выборочно воздействует на возможность выработки различных пищеварительный ферментов грибным мицелием. Изменение компонентов среды позволяет сохранить широкую ориентированность пищеварительной системы и повысить выживаемость мицелия. Виды сильно отличаются по своим предпочтениям. И если у вас нет определённых данных на этот счёт, то вам придётся идти путём проб и ошибок.
3. Получив количество мицелия необходимое для производства грибницы верните штамм на хранение до следующего использования. Не ждите что мицелий росший несколько лет при оптимальных температурах сохранит свойства первоначальной культуры из которой он был получен. Вследствие многочисленных делений клеток и непрерывных пересадок с большой вероятностью выделился подштамм, который имеет отдалённое сходство с жизнеспособностью, внешним видом и потенциалом плодоношения оригинала.
4. Если все усилия направленные на сохранение жизнеспособного штамма провалились, следует выделить новый из мультиспоровой культуры.
5. Другой альтернативой являются постоянные эксперименты с целью создания гибрида штаммов скрещивая дикариотические мицелии двух генетически отличающихся родителей. (Однако эксперименты с Agaricus brunnescens показали что большая часть гибридов плодоносит меньше, чем кто-либо из задействованных в скрещивании штаммов. И лишь меньшая их часть даёт хорошие урожаи.)

Домашние культиваторы могут выборочно развивать штаммы грибов выбирая мицелий по следующим нескольким признакам:

1. Ризоморфизм – быстро развивающийся и разрастающийся мицелий
2. Чистота штамма – отсутствие ватных секторов.
3. Чистота мицелия – отсутствие конкурирующих микроорганизмов (бактерий, плесеней и клещей).
4. Время задержки реакции в ответ на создание условий благоприятствующих образованию примордий.
5. Количество появившихся примордий.
6. Коэффициент прорастания появившихся примордий.
7. Размер, форма и/или цвет плодовых тел.
8. Общий урожай.
9. Сопротивляемость заболеваниям.
10. Чувствительность/переносимость C02.
11. Температурные ограничения.
12. Простота сбора урожая.

Используя эти характерные особенности, грибные селекционеры смогут разумно оценить качество штаммы и со временем научатся выбирать из них те, которые наилучшим образом соответствуют их предпочтениям.

shroomery.nl

No Comment

Вы можете первым оставить коментарий

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *